cas9基因敲除步骤 cas12b基因敲除原理图解

关于CAS9

是可以学一下SnapGene这个软件的使用方法（有主要功能视频），个人认为，自行查资料理解每一个元件的含义和作用，可以帮助更快的补充背景知识。通过将散落的知识点起来，拼凑成自己的知识地图。

Cas9系统 能在293T, K562, iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ）、同源重组 （HR）效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当，多个靶点可以同时进行靶向酶切，进一步靶向基因纵推向，使得多个基因敲除、敲入变得更为简单、高效

cas9基因敲除步骤 cas12b基因敲除原理图解

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做基因敲除如何快速筛出阳性克隆？

因为敲除：在外显子上设计gRNAcas9切割，造成双链断裂，当缺失的碱基数为3的倍数，修复后可发生移码突变没看懂又中途跑去看了一波中文

通过法，化学转染法或电转法将gRNA和Cas9转入细胞中，根据转染方法不同进行不同时长的筛，筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证，筛选出基因敲除的阳性克隆。

CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后

简述crisprcas9的原理和用途如下：

简单整理一下：

protocol-使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑（一）

protocol-使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑（二）

CRISPR-Cas习笔记

不多的时候，在师兄带领下，学习设计了一下sgRNA（讲真，这部分我真是什么都不懂，全靠师兄演示之后再自行补充背景知识）

CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计

此外，还有CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi)的原理是相似的。正是由于这种的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。CRISPR/Cas9是继锌指内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。在TALEN和ZFN的时代，科学家们往往要花费重金，把基因编辑工作交给生物公司。而现在，在实验室里，人们就可以使用CRISPR/Cas9技术轻松的实现基因编辑。穿插学习的内容

FLP-FRT系统--诱导性基因编辑inducible gene editing

设计了sgRNA之后怎么办呢？？还是这篇文章

（1）首先是实验设计

详情见：CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计

将这部分内容整合到Cas9 expression plaid pSpCas9（Cas9表达质粒）中，一起共转。

现在我要用这个方法来举例

找到包括sgRNA序列的前后1000个碱基的序列（2000 bp）

找到的序列如下：

将上面的序列粘贴到blast中

系统反馈说我提交的序列和数据中的某基因很像，问我是不是就用下面这个 。

选和不选我都试过了，选择的话，得到的引物有两对，如下（摘选了其中一个）：

如果不选的话

简述crisprcas9的原理和用途

CRISPR-Cas9技术原理：CRISPR-Cas9技术包含两种重要的组分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的gRNA。CRISPR-Cas9技术利用一段与靶序列互补的gRNACas9酶对特异靶向DNA进行识别和切割，造成DNA的双链或单链断裂，然后，细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复，即非同源性末端接合或同源介导的修复。

CCre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记 RISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。

以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组修饰。

专利授权

2014年4月15日，获得了美国专利与商标局关于CRISPR的个专利授权。专利权限包括在真核细胞或者任何细胞有细胞核的物种中使用CRISPR。这意味着拥有在除细菌之外的所有生物，包括老鼠、猪和人身上使用CRISPR的权力。

crispr cas9基因敲除原理是什么？

将sgRNA放到U6后面，利用U6的启动来扩增sgRNA。1.外源DNA俘获：“黑名单”登记

crispr cas9技术原理

1. 更的（但不是更方便的）单个基因的knockout

CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的，可sgRNA的合成和投递有两种方式：A）PCR；B）单独的sgRNA的表达质粒。用于基因敲除，基因敲入，功能基因组筛选，疾病治疗等领域

CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计

在学生信的时候，听到过一个词，“可变剪接”，有了初步印象之后，在这里才算是实实在在看到了，我认真的数了数，mRNA画了15条，TP53蛋白也画了15条。那么我们可以理解为，TP53有15个亚型，当然，每个亚型都有自己的mRNA。

大佬说，我只说一次，你自己要记住

以最火热的p53为例

怎么样才能通过尽量少的sgNRA数量，去敲除尽量多的TP5这个很好理解，在编辑片段中加入抗生素抗性基因或者荧光基因后，可通过抗生素筛选或者FACS分离。3蛋白。既然是做knockout，那一定是要所有的亚型都不能表达。那么既然如此，就是要敲除掉这些亚型共有的区域，而且越前面越好（如果只敲除尾巴，TP53合成了半个身子，半个身子的TP53说不定也能起作用），另外，也不能敲除掉内含子（说是，如果敲掉了，可能会形成进的剪接，就有新的蛋白出现）----知识点好伐~

首先，先附上鼎鼎大名的张峰实验室提供的网页

有人用CRISPR/Cas9系统做细胞基因敲除吗交流下

CRISPR/Cas9基因敲除的原理是利用gRNA特异性识别靶序列，Cas9内切酶对靶序列的PAM上游进行切割，造成靶位点DNA双链断裂，再利用生物体自身的DNA损伤修复应答机制，将断裂上下游两端的序列连接，实现目标基因的敲除。

基因敲除是上个世纪90年代出现的外源DNA导入技术。分为完全基因敲除和条件基因敲除。

基因敲除技术的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，自身发展的同时也促进了相关技术的进一步发展。流程大概是这样的：首先获得小鼠ES细胞系，测试ES细胞嵌合入受体囊胚的能力之后根据不同基因、不同目的设计并构建打靶载体，将打靶载体转入一定数目ES细胞中，然后鉴定出带有发生正确同源重组的突变中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞可以发育为嵌合体动物的细胞，是的经过修饰的遗传信息经系遗传，从而得到带有修饰基因的突变小鼠，而后可以对其进行表型分析。

目前，在ES细胞中进行同源重组已经成为一种研究特定基因甚至基因的特定结构域和对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。1997年通过基因打靶获得的突变小鼠就已经超过千种，近年来随着基因敲除技术的不断进步，尤其是DNA重组技术和小鼠基因组测序的完成，使得建立基因敲除小鼠的周期大大减少，使基因敲除小鼠数目大大增加。各国也都建立了突变体小鼠及转基因小鼠的数据库。

06年8月七日，美国国立卫生研究院宣布将投巨资启动敲除小鼠基因组，目的是建立一个完善、免费的小鼠基因组突变基因数据库，研究人员可以利用基因敲除小鼠研发能为治疗癌症、心B）sgRNA表达质粒的方法病、神经退行性疾病、糖尿病等人类遗传疾病提供更为的动物模型。

CRISPRCas9精细原理基因敲除点突变基因插入解读

CRISPR-Cas9用途：利用两种修复机制，可以实现基因的插入和敲除。没有模板的情况下，利用NHEJ修复，随机插入或缺失序列造成基因敲除。有模板存在的情况下，可通过HDR修复在剪切位点引入目的修饰基因，实现基因的定点修改。

敲入：gRNA和cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，细胞以外源携带敲入片段的DONOR作为模板进行同源重组修复（HDR），将敲入片段重组到基因组靶点。

点突变：gRNA和cas9复合物造成靶位点DNA双链断A）PCR扩增的方法裂后，细胞以外源携带目标点突变的Donor作为模板进行同源重组修复（HDR），将目标点突变重组到基因组靶位点。

用cas9基因敲除不同转录本怎么设计grna

我没有写结果怎么查看，或者分析结果耶，因为。。。因为做到这里，真正想学的人，感兴趣的人早就去看了。

这要具体分析，如果这个基因存在可变剪接，那就看这个基因是否有外那么，CRISPR序列是如何与Cas蛋白配合来执行防御功能的呢？整个过程大体分为3步。显子（不为三的整倍数的外显子）是这些转录本里共有的，如果是就可以在这个外显子上设计sgRNA，这样就可以敲除掉这个外显子和其后的外显子（因为移码突变导致的提前翻译终止）。如果没有这样的外显子那就只能在不同的外显子上设计多条sgRNA，然后筛选这几个转录本都敲除成功的细胞系或实验动物就可以了（毕竟应用Cas9技术能够实现多基因敲除）。